蛋白質定量分析

蛋白質定量分析


利用定量蛋白質組學技術,研究蛋白質在不同生理狀態、疾病階段的表達量變化,篩選差異蛋白表達譜,尋找生物體在生理刺激、調控途徑中發揮重要作用的關鍵蛋白質,對其功能進行探究,是蛋白質組學的核心內容。


一、 ITRAQ標記定量蛋白質組學分析???????


iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolutequantitation, iTRAQ)是由AB SCIEX公司研發的一種體外同重同位素標記的相對與絕對定量技術。該技術利用4種或8種不同簽的同位素試劑特異性地標記不同樣品中的蛋白多肽氨基基團,標記的樣品等量混勻后,經液相色譜分離及串聯質譜(MS/M)分析,可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對表達量信息,通過生物信息學分析即可鑒定出所測蛋白及其在各樣品中的表達差異 。???????

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iTRAQ試劑由三部分組成:報告基團、質量平衡基團和反應標記試劑基團,形成4種或8種相對分子質量均等量(145或305)的異位標簽iTRAQ試劑用于標記酶解后的肽段。在質譜中,任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比。在串聯質譜中,報告基團、質量平衡基團和多反應基團之間的鍵斷裂,質量平衡基團丟失,帶不同同位素標簽的同一多肽產生不同的報告離子,根據報告離子的信號強度可獲得樣品間相同肽段的定量信息,再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。???????

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定量蛋白質組學


技術特點:

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1、靈敏度高:可檢測出較低豐度蛋白,胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等;

2、分離能力強:可分離出酸/堿性蛋白,小于10K或大于200K的蛋白、難溶性蛋白;

3、高通量:可同時對8個樣本進行分析,特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析;

4、結果可靠準確:定性與定量同步進行,同時得出鑒定和定量結果,重復樣品間的蛋白表達量相關性可達到0.95以上;

5、兼容性高:標記所有的肽段,包括翻譯后修飾,提高了蛋白質組的覆蓋率,而且提高了鑒定和定量的可信度。???????

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ITRAQ 標記定量流程:???????

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定量蛋白質組學?


二、TMT標記定量蛋白質組學分析????

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TMT?(Tandem Mass Tag?)技術是由美國Thermo Scientific公司研發的一種多肽體外標記技術。TMT與iTRAQ試劑在結構和檢測原理上基本類似,也是由報告基團、平衡基團和肽反應基團三部分組成。? 該技術采用2種、6種或10種同位素的標簽,通過特異性標記多肽的氨基基團,然后進行串聯質譜分析,可同時比較2組、6組或10組不同樣品中蛋白質的相對含量。其技術特點與iTRAQ類似。???????

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定量蛋白質組學


三、LABEL-FREE 非標記定量蛋白質組學分析???????


定量蛋白質組學

定量蛋白質組學

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四、SILAC定量蛋白質組學???????


細胞培養條件下穩定同位素標記技術(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC),利用含輕、中或重型同位素標記的必需氨基酸(主要是Lys和Arg)培養基培養細胞,來標記細胞內新合成的蛋白質,一般培養5-6代,細胞中的蛋白質將都被同位素標記。不同處理的蛋白樣品等量混合,經SDS-PAGE分離,切膠,酶消化,LC-MS/MS分析即可得到有關蛋白的定量及定性結果。?? SILAC在比較蛋白質組學,蛋白與蛋白互作,蛋白與DNA互作,蛋白與RNA互作等研究領域均有廣泛應用。???????

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1、高通量,可同時標記細胞內的蛋白,與質譜聯用可同時分析鑒定多種蛋白;

2、同位素標記效率高、穩定,不受裂解液影響,結果重復性好,可信度高;

3、靈敏度高,實驗所需蛋白量明顯減少;

4、體內標記,結果更接近真實生理狀態???????

?定量蛋白質組學?


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