定量N糖基化蛋白質組分析

蛋白質的N-糖基化位點修飾是極其重要的蛋白質翻譯后修飾之一,主要在復雜的多細胞或組織形成過程中起關鍵作用,參與細胞與細胞的連接、受體配體的相互作用、免疫應答、細胞凋亡及各種發病機理等生物學過程。蛋白質的N-糖基化修飾位點具有保守的氨基酸序列NX(S/T),其中X為除脯氨酸以外的其它氨基酸。

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糖分子自身的復雜性和許多N-glycoproteins低表達水平使得對N-glycosylation結構的表征的描述極為困難。在檢測低豐度的N糖基化修飾蛋白或肽段時,其中摻雜大量未修飾的蛋白肽斷,這很容易將低豐度的糖基化修飾蛋白肽段的信號掩蓋,目前采用凝集素親和富集解決這一問題。

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定量N糖基化蛋白質組分析

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凝素親和法是目前糖蛋白質組學中應用相當廣泛的分離富集方法。凝集素(lectin)是一類糖結合蛋白質,能專一識別某一特殊結構的單糖或聚糖中特定的糖基序列而與之結合,它們與糖鏈可逆非共價結合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲之后,通常用特定的單糖通過競爭結合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。蛋白質經過酶解后利用凝集素(lectin)富集N-糖基化肽段,然后用N-糖酰胺酶(PNGase)在H218O中切除連接在天冬酰胺殘基(Asn)上的糖鏈。該處理致使Asn分子量增加2.9890Da。最后用高精度LC-MS質譜儀檢測脫糖后的肽段,通過檢索數據庫,確認脫糖后分子量與其理論分子量的變化以及糖基化修飾肽段的序列,從而確定該蛋白質的N-糖基化位點。

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N-糖基化位點確定之后,再利用label-free的原理對其進行定量分析。

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應用領域

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1.不同實驗條件下糖基化蛋白質組變化及信號通路分析;

2.篩選候選糖蛋白標志物;

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技術流程


定量N糖基化蛋白質組分析

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技術特點


?大規模的蛋白質組N-糖基化位點的鑒定與分析。



樣品要求


樣品類型

樣品要求

植物葉片

濕重≥3g

植物根莖、木質部、韌皮部等

濕重≥5g

細胞樣品

細胞量濕重≥5*107

組織樣品

人、動物、微生物濕重≥50mg;

體液樣品

血清、血漿體積≥200μl,、腦脊液≥500μl,尿液≥1000μl



應用案例


Zielinska DF, Gnad F, et al. Mapping N-glycosylation sites across seven evolutionarily distant species reveals a divergent substrate proteome despite a common core machinery. Mol Cell. 2012; 46(4): 542-8.


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